Химиопрепараты для лечения гриппа - современное состояние

История химиотерапии вирусных инфекций на­чинается с конца 60-х - начала 70-х гг., когда были установлены противовирусные свойства произво­дных адамантана, и началось широкое применение амантадина и реимантадина в период пандемии Гонконгского гриппа 1967-1968 гг. В 70-80-е гг. СССР был лидирующей страной в мире по разра­ботке и применению противовирусных препаратов для лечения и профилактики гриппа [1, 2]. За про­шедшие годы накоплен значительный опыт в применении химиопрепаратов, разрабатываются новые средства лечения и профилактики гриппа и острых респираторных вирусных инфекций [3, 4]. Однако этиотропные средства для лечения гриппа и ОРВН представляют собой крайне ограниченную группу лекарственных препаратов. Если сравнить выбор противовирусных препаратов с современным набо­ром антибиотиков, то станет понятно, что создание препаратов против вирусных инфекций - это бли­жайшая перспектива развития медицинской науки в области создания средств лечения и профилактики вирусных инфекций.

Всемирной организацией здравоохранения для лечения гриппа рекомендовано применение препа­ратов этиотропного действия, оказывающих непосредственное воздействие на вирусную репродук­цию. Сейчас в мире используются два поколения таких препаратов [5].

Римантадин (амантадин), препарат из группы адамантанов на протяжении многих лет применя­ется в терапии гриппа и зарекомендовал себя как высокоэффективное средство в борьбе с гриппозной инфекцией, вызванной гриппом типа А. Разработка и создание препаратов - ингибиторов нейраминида- зы (озельтамивир (тамифлю) и занамивир (реленца) явились достижением в области фармакотерапии гриппа, т. к. появился новый класс этиотропных средств для лечения гриппа типов А и В.

В табл. 1 представлен сравнительный анализ те­рапевтических свойств наиболее известных препа­ратов, использующихся для лечения гриппа.

Римантадин

В 1960 гг. появился первый этиотропный препа­рат для лечения гриппа - амантадин. Амантадина гидрохлорид изначально разрабатывался и исполь­зовался для лечения болезни Паркинсона. В 1963 г. Jackson и соавт. [6] сообщили о его противогрип­позной активности в отношении вируса гриппа ти­па А.

Римантадин (а-метил-1-адамантанметиламин) (рис. 1), производное адамантана - трициклического углеводорода С10Н10, был открыт в 1965 г. в США в ходе выполнения первой скрининг-программы по по­иску активных антивирусных соединений. В 1975 г. римантадин отечественного производства был раз­решен для лечения гриппа типа А.

Римантадин является препаратом строго на­правленного действия на вирусспецифическую мишень, локализованную в трансмембранной об­ласти минорного поверхностного белка М2 вируса гриппа [7], который формирует в виде гомотетра- меров ионные каналы, пропускающие поток Н+ внутрь вирионов. При этом происходит градиент­ное понижение рН с 7,0 до 5,0-6,0, при котором структуры вириона дезагрегируются и комплексы РНП освобождаются от внешних оболочек, что необходимо для последующей реализации вирус­ной программы в ядрах и цитоплазме зараженной клетки. Молекула римантадина, соответствующая по размерам диаметру ионного канала, блокирует транспорт протонов, что приводит к стабилизации рН в пределах физиологических значений. Вслед­ствие подавления активности ионного канала ви­руса гриппа, останавливается поток протонов через мембраны вирионов и эндосом. В результате нару­шается процесс диссоциации М1 белка (основного матриксного протеина) и не происходит высвобож­дение нуклеокапсида и, следовательно, его транс­крипционной активации.

Таблица 1

Препараты адамантанового ряда, являясь мембра­но- и лизосомотропными агентами, накапливаются в мембранах и препятствуют конформационным из­менениям НА, необходимым для протеолитической активации функции «слияния» НА2 с клеточными мембранами [8]. Более того, существенным являет­ся действие рН на диссоциацию липопротеиновой мембраны вирионов и, следовательно, освобожде­ние нуклеопротеида.

К этому следует добавить, что римантадин адаман- тановым ядром прочно связывается с так называемым адамантан-связывающим сайтом белка М2. Эта связь необратима, поэтому римантадин можно отнести к суицидным для белка М2 ингибиторам. именно этим и объясняется высокая специфичность римантадина в отношении вирусов гриппа А и его высочайшая эф­фективность при лечении гриппозной инфекции.

Однако высокая специфичность взаимодействия римантадина с одной строго локализованной мише­нью приводит к селекции в организме резистентных штаммов, что подтверждается последними событи­ями - 100% резистентностью вирусов A(H1N1)pdm 2009 к препаратам адамантанового ряда.

В течение последних лет отечественными уче­ными велись работы по снижению токсичности римантадина и созданию молекулярной формы препарата, максимально приспособленной для де­тей. Результатом разработок, явилось создание по­лимерного препарата орвирем. орвирем, сохраняя спектр противовирусной активности своего пред­шественника, мало токсичен. Подавление репро­дукции вируса гриппа препаратом орвирем со­провождается индукцией интерферона как второго уровня защиты, что позволяет усилить химиотера­певтическое действие препарата. Орвирем, так же как и римантадин, активен в отношении штаммов вируса гриппа А, кроме того, оказывает антиток­сическое действие при ОРВИ и гриппе, вызванном вирусом типа В.

Ингибиторы нейраминидазы

Принципиально новым разделом химиотерапии вирусных инфекций стал целенаправленный дизайн ингибиторов нейраминидазы (рис. 2). Эти работы имеют интересную историю эволюции подходов, венцом которой стал действительно целенаправлен­ный (рациональный) дизайн ингибиторов с исполь­зованием данных о третичной структуре нейрами- нидазы вируса гриппа.

Нейраминидаза - фермент, контролирующий, путем отщепления остатков сиаловых кислот от ге- магглютинина, процессы почкования и высвобожде­ния зрелых вирусных частиц от мембран инфициро­ванных клеток. Кроме этого нейраминидаза играет определенную роль в начальных стадиях проникно­вения вирусов гриппа в клетки, то есть в их инфи­цировании. ингибиторы нейраминидазы блокируют эти процессы.

В 1995 г. появился новый ингибитор нейрами­нидазы вируса гриппа - занамивир (рис. 2) [9]. При проведении клинических испытаний по лечению и профилактике гриппа типа А и В была показана вы­сокая эффективность препарата.

Однако этот препарат имеет низкую биодоступ­ность при пероральном применении и вводится в дыхательные пути с помощью ингалятора или ин- траназального аэрозоля. Естественно оставалась нерешенной задача разработки перорального препа­рата с достаточно высокой биодоступностью и со­хранением противовирусной активности.

Первый пероральный ингибитор нейраминидазы озельтамивир фосфат (Тамифлю) (см. рис. 2) был вы­пущен в продажу в 1999 г. Клинические испытания озельтамивира продемонстрировали высокую эффек­тивность препарата при лечении, начатом в первые 36 часов заболевания [10]. Эти клинические иссле­дования показали, что одним из самых принципиаль­ных недостатков препарата является необходимость его раннего применения. Проблема своевременного обращения за медицинской помощью и раннего ле­чения респираторных вирусных инфекций относится к наиболее острым проблемам практического здраво­охранения. основная часть пациентов обращается за медицинской помощью только на 2-3-и сутки, когда становится очевидным, что лечение только жаропо­нижающими препаратами неэффективно. Однако уже с тяжелыми формами гриппа и вирусными пневмо­ниями пациенты поступают в клиники только на 5-е сутки. Профилактический прием и раннее лечение, когда диагноз окончательно не установлен, сильно компрометируются побочными эффектами препарата - тошнота (15%), диарея (9,5), боли в животе (4,7%). Более того, проблема появления резистентных к ин­гибиторам нейраминидазы штаммов вируса гриппа заставила отказаться от профилактического исполь­зования препаратов данной группы.

В 2009 г. FDA разрешен к применению перами- вир - внутривенный ингибитор нейраминидазы ви­руса гриппа.

Арбидол

Препарат, активный против вирусов гриппа типов А и В - арбидол (аналог азотистых оснований), по­явился в России в 80-е годы (рис. 3). В дальнейшем оказалось, что арбидол действует против многих вирусов, вызывающих ОРВИ [11]. Такую широкую активность препарата связывают с его способно­стью стимулировать синтез интерферона. Арбидол - противовирусный препарат, представляющий со­бой 1-метил-2-фенилтиометил-3-этоксикарбонил-4- диметиламинометил-5-гидрокси-6-броминдол. Пре­парат арбидол является примером блочного дизайна соединений на основе индола (рис. 3). Анализ ме­ханизмов действия этого препарата на репродукцию вирусов гриппа показал, что в отношении вирусов гриппа типа А данный препарат достаточно специ­фично распознает молекулы гемагглютинина обла­сти N - конца НА2.

Были получены данные, которые позволили сде­лать вывод о том, что арбидол ингибирует слияние липидной оболочки вируса гриппа с плазматически­ми мембранами клетки, индуцируемое низким уров­нем pH, что может быть обусловлено встраиванием препарата в липидные мембраны и влиянием на кон- формационные изменения гемагглютинина (HA). Таким образом, арбидол ингибирует освобождение вирусного нуклеокапсида. Характеризуется анти­оксидантным действием, защитой клетки от воздей­ствия перекисных соединений [12].

Среди новых препаратов для лечения и профи­лактики вирусных инфекций продолжают привле­кать особое внимание препараты интерферона и ин­дукторы интерферона.

Интерфероны I-II типов

Интраназальное применение интерферонов име­ет достаточно длительную историю применения для профилактики и лечения гриппа.

В течение длительного времени аэрозольный способ применения лекарственных препаратов не­случайно привлекал к себе внимание. Основными воротами при заражении гриппом являются верхние дыхательные пути и все процессы, связанные с пора­жением эпителия верхних дыхательных путей, раз­виваются в носоглотке. Активация и размножение вируса в верхних дыхательных путях занимает от 12 ч до 3-х дней. Далее события разворачиваются в полной зависимости от степени патогенности виру­са. Из этого следует, что разработка методов местно­го лечения гриппа с применением интраназальных форм цитокинов является чрезвычайно актуальным. Очевидно, что такое лечение должно начинаться с первых симптомов гриппа. Известно также, что интраназальное и интратрахеальное применение противовирусных препаратов и, в частности, интер- феронов, способствует снижению контагиозности зараженных лиц, что приводит к ограничению рас­пространения инфекции в очагах.

В настоящее время в препаратах для интрана- зального применения основным активным компо­нентом является альфа-2-интерферон (например, Альфарона). Интерферон-гамма относительно не­давно вошел в клиническую практику. Доказано, что интерферон-гамма является уникальным средством защиты от особо опасных вирусных инфекций [13].

Нельзя не отметить, что интерферон-гамма основной цитокин, способный быстро активиро­вать НК-клетки - второй уровень защиты орга­низма от наиболее опасных вирусных инфекций. способность интерферона-гамма стимулировать Т-клеточный ответ создает основу для сильного ци­тотоксического иммунитета и фактически обеспе­чивает реконвалесцентам, находящимся на терапии интерфероном-гамма перекрестный иммунитет в отношении одного и того же подтипа вируса грип­па вне зависимости от дрейфа поверхностных анти­генов. Интерферон-гамма стимулирует созревание плазмацитоидных дендритных клеток, тем самым активирует презентацию вирусных антигенов и соз­дает благоприятные условия для комбинированного цитокинового ответа на репродукцию вирусов с по­следующим развитием устойчивого защитного им­мунитета. Результаты клинических исследований свидетельствуют о том, что оптимальным для при­менения интерферонов является сочетание интерфе- ронов - альфа и гамма, что соответствует физиоло­гическим условиям врожденного иммунного ответа на гриппозную инфекцию [14].

Индукторы интерферонов

Среди препаратов для лечения и профилактики вирусных инфекций продолжают привлекать осо­бое внимание индукторы интерферонов, которые занимают определенное место в терапии вирусных инфекций, как корректоры иммунитета в период развития иммунного ответа на инфекционный про­цесс для эффективного завершения терапии и пре­дотвращения хронизации процесса, осложнений и рецидивов.

Циклоферон (производное акридонуксусной кис­лоты) (рис. 4) обладает широким спектром противо­вирусной активности, эффективен в отношении ряда бактерий, простейших [15]. Данный препарат может быть условно отнесен к противовирусным препара­там, т. к. не проявляет прямого противовирусного эффекта, т. е. не имеет вирусспецифических мише­ней. Вместе с тем, циклоферон является одним из наиболее функциональных и сильных индукторов интерферонов 1-го типа. В связи с этим данный пре­парат незаменимое средство профилактики гриппа и других вирусных инфекций, особенно в условиях экстренной профилактики. Для данного препарата показаны как начальные (продромальные) стадии заболевания, так и период реконвалесценции.

Циклоферон, обладая высокой степенью биодо­ступности, проникает через гематоэнцефалический барьер, что позволяет использовать его при нейро­инфекциях. очевидны несомненно важные свой­ства циклоферона в отношении быстрой индукции интерферона (2 ч), что позволяет его рекомендовать в качестве дополнительного препарата для лечения острой фазы вирусной инфекции.

Другой низкoмолекулярный индуктор эндоген­ного интерферона - амиксин (рис. 5), относится к синтетическим соединениям класса флуоренов.

Строение препарата свидетельствует о том, что его можно отнести к препаратам с наличием двух сайтов связывания: коровый флуоренон, путем стэкинг-взаимодействия, стабилизируется по пло­скостям азотистых оснований, а боковые, положи­тельно заряженные заместители, как бы закрепляют его на фосфатном скелете ДНК или РНК [16]. Таким образом, амиксин не только индуцирует выработку интерферона в организме, но должен обладать спо­собностью прочно связываться с ДНК, РНК нуклео- протеидами, и тем самым проявлять прямую про­тивовирусную активность в отношении широкого спектра вирусов.

Существуют также основания полагать, что фар­макологическое действие амиксина обусловлено рядом механизмов: прямая ингибиция ревертазы, ингибирование трансляции вирусспецифических белков, интеркаляция в ДНК вирусов и клеток. Про­являя активность к прямому подавлению реплика­ции вирусных нуклеиновых кислот, амиксин одно­временно обеспечивает сильную и продолжитель­ную индукцию эндогенного интерферона a-, b- и g-типов и активно влияет на процессы становления иммунитета против вирусных инфекций. однако было установлено, что в системах in vitro препарат обладает значительной токсичностью, с чем и свя­зана лечебная и профилактическая схемы его при­менения.

В практике отечественного здравоохранения сложилась система последовательного применения противовирусных препаратов, интерферона и ин­дукторов интерферона при лечении вирусных ин­фекций. В острый период заболевания необходимо применять прямые ингибиторы репликации, снижая тем самым виремию. однако после купирования острых явлений и виремии возможно применение индукторов интерферонов для стимуляции процес­сов активации иммунитета и сероконверсии. Следу­ет также подчеркнуть, что в острой репликативной стадии инфекции высокоэффективно применение рекомбинантных препаратов a-2-интерферона, ког­да проявляется их противовирусная активность. А в подострый период и период реконвалесценции на­ряду с индукторами интерферонов, высокая эффек­тивность доказана для рекомбинантных препаратов у-интерферона.

Ингавирин

Новая разработка отечественных ученых - пре­парат ингавирин [17], является имидазолилэтанами- дом пентадиевой кислоты (рис. 6).

Ингавирин обладает выраженным противовоспа­лительным действием, обусловленным подавлением продукции ключевых провоспалительных цитоки­нов (ФНО-a, ИЛ-ір и ИЛ-6). По данным авторов, ингавирин вызывает генерацию цитотоксических лимфоцитов и повышает содержание NK-T-клеток, обладающих высокой киллерной активностью по отношению к трансформированным вирусами клет­кам и выраженной противовирусной активностью. По другим данным он является ингибитором олиго­меризации белка NP вирусов гриппа.

В заключение необходимо отметить, что раз­работка противовирусных препаратов в последние годы стала одним из наиболее актуальных направ­лений в современной фармакологии. Потребность в новых противовирусных препаратах особенно остро определилась в последние годы после эпи­демии «птичьего» гриппа и пандемии гриппа, вызванного вирусом A(H1N1) pdm2009. С одной стороны, это связа­но с быстрым распространением рези­стентности к препаратам адамантаного ряда и ингибиторам нейраминидазы, а с другой стороны, очевидно, что в ме­дицинской практике необходимо иметь достаточно обширный выбор препаратов с учетом индивидуальной переносимости, противопоказаний, побочных эффектов, стадии и тяжести заболевания и, наконец, сопутствующей патологии и лекарствен­ной совместимости.

В настоящее время ряд новых этиотропных пре­паратов для лечения гриппа находится на завер­шающих стадиях клинических испытаний и в бли­жайшем будущем может составить значительную конкуренцию на фармацевтическом рынке противо­гриппозных препаратов.

Один из них новый отечественный противовирус­ный препарат триазавирин, относящийся к классу азоло-азинов [18]. В доклинических исследованиях триазавирин показал высокий уровень и широкий спектр противоирусной активности в отношении гриппа А и В (в том числе резистентных к адаман- танам и ингибиторам нейраминидазы штаммам), респираторно-синцитиальной вирусной инфекции, клещевого энцефалита, геморрагических лихора­док. По результатам токсикологических исследова­ний триазавирин является малотоксичным соеди­нением, что позволяет широко варьировать дози­ровками и разрабатывать различные лекарственные формы. Более того, уникальный механизм действия триазавирина позволяет достигнуть множественных фармакологических эффектов. триазавирин блоки­рует негативное действие сигналов окислительного стресса через цГМф и No- сигнальные пути, ком­пенсируя негативное действие вируса на клетки че­рез интерференцию с процессами S-гуанилирования и S-глютатионирования. Вторым важным компонен­том действия триазавирина в условиях окислитель­ного стресса является его способность к связыванию с гемагглютинином вируса гриппа, что приводит к блокаде функции слияния гемагглютинина, необхо­димой для инфицирования клеток.

Клинические исследования II фазы по оценке эффективности и безопасности препарата триаза- вирин показали его высокую терапевтическую эф­фективность при лечении пациентов с диагнозом грипп. Было показано, что использование триазави- рина способствует сокращению продолжительности основных симптомов заболевания (интоксикации, лихорадки, катаральных симптомов), снижению частоты развития осложнений и объема симптома­тической терапии. На фоне приема триазавирина снижался уровень повторного выделения вирусов гриппа. В настоящее время завершается III фаза кли­нических исследований триазавирина. триазавирин обладает рядом очевидных преимуществ - высокой эффективностью, низкой токсичностью, отсутстви­ем побочных эффектов, возможность создания раз­личных лекарственных форм.

Еще один препарат, находящийся на III фазе кли­нических исследований - аналог нуклеозидов фа- випиравир (Favipiravir, Т-705), обладает широким спектром противовирусной активности. В докли­нических исследованиях показана его активность в отношении гриппа, геморрагических лихорадок. Получены данные по эффективности препарата в отношении штаммов вируса гриппа, резистентных к ингибиторам нейраминидазы и блокаторам ионного канала белка М2. Механизмом действия фавипира- вира является прямое ингибирование РНК - зависи­мой РНК - полимеразы вируса гриппа [19].

Продолжается разработка новых ингибиторов нейраминидазы вируса гриппа. В этом ряду уникаль­ное место занимает новый рекомбинантный препа­рат - DAS181 (FludaseH) - флюдаза, состоящий из последовательности сиалидазы актиномицетов и якорного домена амфирегулина - тканеспецифиче­ского белка эпителия верхних дыхательных путей. Флюдаза эффективно адсорбируется на эпители­альных клетках и катализирует удаление сиаловых остатков с клеточной поверхности [20]. Удаление сиаловых остатков с клеточной поверхности «по­тенциально» снижает способность вирусов гриппа к инфицированию эпителиальных клеток, в связи с полной зависимостью способности вируса к инфи­цированию клеток от доступности специфических сиаловых рецепторов. Разработка этого препарата представляет особый интерес для дальнейшего раз­вития направления аэрозольного лечения респира­торных инфекций. В 2010 г. инициирована II фаза клинических исследований препарата в терапии па­циентов с диагнозом грипп.

В заключение необходимо отметить, что особое внимание в разработке противовирусных препара­тов обращается на соединения, структура и меха­низмы действия которых исключают возможность развития лекарственной резистентности и обладают высоким химиотерапевтическим индексом.

ЛИТЕРАТУРА

1. Злыдников Д.М., Казанцев А.П., Старшов П.Д. Терапия ви­русных инфекций. Л.; 1979: 21-2.
2. Смородинцев А.А. Принципы поиска, изучения новых про­тивовирусных химиопрепаратов и место химиопрофилак­тики гриппа в системе противогриппозных мероприятий. В кн.: Химиопрофилактика и химиотерапия гриппа. Л.; 1972: 11-8.
3. Киселев О.И., Маринич И.Г., Соминина А.А, ред. Грипп и другие респираторные вирусные инфекции: эпидемиология, профилактика, диагностика и терапия. СПб.; 2003.
4. Киселев О.И., Деева Э.Г., Слита А.В., Платонов В.Г Антиви­русные препараты для лечения гриппа и ОРЗ. Дизайн препа­ратов на основе полимерных носителей. СПб.: Время; 2000.
5. Деева Э.Г Грипп. На пороге пандемии. Руководство для вра­чей. М.: Гэотар-Медиа; 2008.
6. Jackson G.G., Muldoon R.L., Akers L.W. Serological evidence for prevention of influenzal infection in volunteers by an anti­influenzal drug adamantanamine hydrochloride. Antimicrob. Agents Chemother. 1963; 161: 703-7.
7. Киселев О.И., Блинов B.M., Козелецкая К.Н. Молекулярный механизм действия антивирусных препаратов адамантаново- го ряда. Вестник РАМН. l993; 3: 10-5.
8. Киселев О.И., Блинов В.М., Платонов В.Г Организация бел­ков М1 и М2 в мембранах и молекулярная модель действия ремантадина. В кн.: Киселев О.И., ред. Химиотерапия и хи­миопрофилактика гриппа и ОРЗ. Л.; 1990: 10-6.
9. Деева Э.Г., Мельникова Т.И. Антивирусные препараты для профилактики и лечения гриппа. Эпидемиология и вакцино­профилактика. 2009; 4 (47): 38-43.
10. Aoki F.Y., MacleodM.D., Paggiaro P. et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. J. Antimicrob. Chemother. 2003; 51: 123-9.
11. Shi L., Xiong H., He J., Deng H., Li Q. et al. Antiviral activity of arbidol against influenza A virus, respiratory syncytial virus, rhinovirus, coxsackie virus and adenovirus in vitro and in vivo. Arch. Virol. 2007; 152: 1447-55.
12. Leneva I.A., Russell R.J., Boriskin Y.S., Hay A.J. Characteristics of arbidol - resistant mutants of influenza virus: implication for the mechanism of ani-influenza action of arbidol. Antiviral Res. 2009; 81: 132-49.
13. Киселев О.И., Деева Э.Г. Ершов Ф.И. Интерферон-гамма: новый цитокин в клинической практике. М.-СПб.: Компания “Димитрейд График Групп®”; 2007.
14. Steinmuller C., Franke-Ullmann G., Lohmann-Matthes M.L., Emmendorffer A. Local activation of nonspecific defense against respiratory model infection application of interferon-y Compari­son between rat alveolar and interstitial lung macrophages. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2000; 22: 481-90.
15. Романцов М.Г. Циклоферон: применение в клинике. М.- СПб.; 1997: 9-11.
16. Киселев О.И. Амиксин - структура, механизмы действия и перспективы применения В кн.: Тезисы конгресса. Человек и лекарство. М., 1998.
17. Зарубаев В.В., Слита А.В., Сироткин А.К., Небольсин В.Е., Киселев О.И. Экспериментальное изучение противовирус­ной активности Ингавирина в отношении аденовируса чело­века. Антибиотики и химиотерапия. 2010; 55: 9-10.
18. Киселев О.И., Деева Э.Г., Мельникова Т.И., Козелецкая К.Н., Киселев А.С., Русинов В.Л., Чарушин В.Н., Чупахин О.Н. Но­вый противовирусный препарат Триазавирин. Результаты II фазы клинического исследования. Вопросы вирусологии. 2012; 57 (6): 9-12.
19. Sleeman K., Mishin V.P., Deyde V.M., Furuta Y., Klimov A.I., Gubareva L.V. In vitro antiviral activity of favipiravir (T-705) against drug-resistant influenza and 2009 a(H1N1) viruses. Anti­microb. Agents Chemother. 2010; 54: 2517-24.
20. Triana-BaltzerG.B., GubarevaL.V., Nicholls J.M. et al. Novel pan­demic influenza A(H1N1) viruses are potently inhibited by DAS181, a sialidase fusion protein. PLoS ONE. 2009; 4(11): e7788.