Подбор оптимальных условий анализа смеси изониазида и тиотриазолина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Ежегодно в мире заболевает туберкулезом 10 млн. человек, 3 млн. умирают, из них 8 тыс. ежедневно. По данным Всемирной организации здравоохранения у 1/3 населения нашей планеты туберкулезная палочка уже содержится в организме[9, 10]. В Украине эпидемия туберкулеза зарегистрирована с 1995 года[7].

Она прогрессирует и приобретает широкие масштабы. По данным статистики в Украине каждый день регистрируется 82 вновь заболевших туберкулезом людей и 30 больных умирает[7]Лечение туберкулеза является сложным делом, требующим долговременного и комплексного подхода[4]. В связи с высокой токсичностью противотуберкулезных препаратов, для снижения токсичности и уменьшения побочных реакций различных групп препаратов, активно применяются антиоксиданты.

Результаты многих экспериментальных и клинических исследований показали, что препарат тиотриазолин    (морфолиний-З-метил-1,2,4-триазолин-5-тиоацетат) обладает высокой антиоксидантной и мембраностабилизирующей активностью[3]. В результате проведенных исследований установлена эффективность создания комбинированного лекарственного препарата, в состав которого входят изониазид (препарат І ряда для лечения туберкулеза) и тиотриазолин (антиоксидант).

Целью нашего исследования является разработка методики совместного определения содержания изониазида и тиотриазолина в искусственной смеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)[1,2,5,6,8], а именно подбор подвижной и неподвижной фазы. Это непростая задача, поскольку оба компонента имеют разную кислотноосновную природу: тиотриазолин имеет кислотный характер, а изониазид является достаточно сильным основанием.

Материалы и методы: для нового комбинированного лекарственного средства, содержащего изониазид и тиотриазолин, необходимо разработать оптимальные методы стандартизации. Для этого нами была изготовлена искусственная смесь, в состав которой входят изониазид и тиотриазолин в соотношении 4:1. Нами была изучена возможность совместного определения действующих веществ в различных подвижных и неподвижных фазах.

Результаты и их обсуждение

Исследования проводились на модельной смеси изониазида и тиотриазолина в соотношении 4:1, которая близка по составу к смеси с оптимальным терапевтическим эффектом. За основу нами была взята известная методика анализа тиотриазолина на обратной фазе с использованием кислого фосфатного буфера (РН3) при длине волны 220 нм. В этих условиях тиотриазолин существует в виде свободной кислоты (время удержания около 8мин.) (рис.1), а изониазид - в виде соли и выходит почти у мертвого объема колонки, что не позволяет корректно проводить его количественный анализ (рис.2).

Фаза - С18.

В дальнейшем наш поиск условий проведения анализа был проведен при варьировании рН и замене фосфатного солевого буфера на органические кислоты (уксусную и муравьиную) и буферные смеси на их основе. Однако буферы на основе органических кислот имеют слишком высокое индивидуальное поглощение при длине волны 220 нм, что снижает чувствительность анализа и нам не пригоден (рис.3).

Далее мы использовали в качестве подвижной фазы 0,1% водный раствор кислоты муравьиной что позволило, по сравнению с фосфатным буфером, незначительно удлинить время удержания изониазида и очень сильно тиотриазолина, при этом значительно удлиняется время анализа. При дальнейшем увеличении рН (при использовании элюентов на базе формиатного буфера) удлиняется время удержания изониазида и уменьшается время удержания тиотриазолина, но при этом значительно ухудшается форма пиков за счет сосуществования протонированых и свободных форм аналитов (рис.4).

Необходимое для совместного определения изониазида и тиотриазолина увеличение времени удержания изониазида возможно получить при добавлении ион-парного реагента (например, додецилсульфоната натрия), в элюент, который содержит 10 % метанола - 90 % фосфатного буфера. К сожалению использование выше упомянутого элюента необратимо модифицирует обратную фазу и делает ее неспособной для работы с другими элюентами, поэтому выше упомянутый анализ требует выделения отдельной колонки, а это требует определенных затрат и является экономически невыгодным.

Альтернативным вариантом является использование полярной цианированной неподвижной фазы и кислых буферных растворов. В этих условиях для водных растворов кислот муравьиной или уксусной предостаточно низких рН (<3.5) наблюдается улучшение формы пиков, уменьшение их ширины. При этом, по сравнению с предыдущими анализами, незначительно увеличивается время удержания изониазида (но достаточно для отделения от пика инжекции на мертвом объеме), и существенно уменьшается время удержания тиотриазолина, что значительно сокращает общее время анализа (рис.5).

АсОНв воде. CN-фаза.

Таким образом, мы считаем перспективным для совместного определения изониазида и тиотриазолина использование цианированной неподвижной и кислой (рН < 3) подвижной фазы. Для дальнейшего увеличения чувствительности анализа (главным образом, для увеличения времени выхода изониазида) целесообразно было изучить возможности использования трифторуксусной кислоты как рН регулятора. В дальнейшем мы уменьшали рН < 3 путем добавления кислоты трифторуксусной, что привело к удовлетворительному разделению изониазида и тиотриазолина и одновременному уменьшению полуширины пиков, по сравнению с подвижными фазами с более высоким рН.

После этого нами были подобраны оптимальные условия проведения анализа: колонка, элюент, скорость подвижной фазы и аналитическая длина волны детектора и объем вводимой пробы. Условия проведения анализа:

• Колонка: Prontosil 120- 5- CN, 250 x 4.0 mm, диаметр частиц 5 мкм;
• Элюент: 0,05 % раствор трифторуксусной кислоты в воде;
• Скорость подвижной фазы 1 мл/мин.
• Аналитическая длина волны детектора: 220 нм;
• Объем вводимой пробы: 20 мкл.
• Образец полученной нами хроматограммы приведен на рисунке 6 .

Вывод

В ходе проведенных исследований по разработке методики анализа изониазида и тиотриазолина при их совместном присутствиив смеси методом ВЖХ была решена непростая задача, а именно - подбор подвижной и неподвижной фазы для действующих веществ, которые имеют разную кислотно-основную природу: тиотриазолин имеет кислотный характер, аизониазид является достаточно сильным основанием.

Кроме того, нами были подобраны оптимальные условия проведения анализа: колонка, элюент, скорость подвижной фазы и аналитическая длина волны детектора и объем вводимой пробы. Полученные в ходе исследований хроматограммы отвечают всем требованиям нормативной документации.

Список литературы

1. Георгиевский Г.В. Разработка комплекса физико-химических методик, обеспечивающих создание и контроль качества оригинальных отечественных препаратов, производных 1,2,4 - триазола// Запорожский медицинский журнал. - 2011, том 13. - №1. - с.58-69.
2. Державна Фармакопея України / Державнепідприємство «Науково- експертнийфармакопейний центр». - 1-е вид. - Харків: РІРЕГ, 2001. - Доповнення 1. - 2004. - 520 с.
3. Мазур И.А., Волошин Н.А., Чекман И.С. Тиотриазолин. - Запорожье, Львов : Наутилус, 2005.- 156 с.
4. Норейко Б. В. Химиотерапиятуберкулеза// Новости медицины и фармации. - 2008. - №19. - с. 261
5. Сапрыкин Л.В. Практика и методические основы высокоэффективной жидкостной хроматографии / Учебное пособие. - Краснодар. 2006. - 151 с.
6. Шатц В.Д. Высокоэффективнаяжидкостнаяхроматография. - Рига: Зинатне, 1988 - 390 с.
7. Фещенко Ю. И. Ситуация с туберкулезом в Украине// Доктор. - 2002. - №4. - с.11-14.
8. Adamovics J.A. Chromatographicanalysisofpharmaceuticals. - NewYork: MarselDekker, 1997.
9. Global tuberculosis control: WHO Report 2002. - Geneva, 2002. - 295 p.
10. Tuberculosis recurrences. Reinfection plays a role in a population whose clinical (epidemiological characteristics do not favor reinfection) / de Viedma D.G., Marin M., Hernangomez S. et al.// Arch. Intern. Med. - 2002. - Vol. 162, № 16. - P. 1873 - 1879