Объявленные ранее цели проекта:
Данный проект был направлен на решение одной из фундаментальных задач клеточной физиологии и патологии, связанной с определением популяционной структуры стромальных остеогенных клеток костного мозга. Конкретная задача проекта заключалась в том, чтобы выяснить, какие сдвиги происходят при старении в структуре популяции стромальных клоногенных клеток (КОК-ф), а также детерминированных (ДОКП) и индуцибельных (ИОКП) остеогенных клеток-предшественников. К детерминированным остеогенным клеткам-предшественникам относятся те костномозговые стромальные клетки, которые способны реализовать свои дифференцировочные потенции в отсутствие специальных индукторов остеогенеза. В отличие от детерминированных, индуцибельные остеогенные клетки- предшественники требуют для костеообразования специальных факторов индукции остеогенеза. ДОКП входят в состав популяции стромальных клоногенных клеток костного мозга, а и ИОКП - в состав популяции стромальных клоногенных клеток селезенки и тимуса. ИОКП также содержатся в периферической крови и соединительной ткани. Существует предположение, что в организме существует единый пул функционально связанных остеогенных клеток- предшественников.
При возникновении дефектов скелета в результате, например, травмы, ДОКП индуцируются к пролиферации, что приводит к образованию новой костной ткани и, тем самым, обеспечивается репарация дефекта. Предполагается, что одновременно, травма кости активирует ИОКП, вызывает их пролиферацию и дифференцировку их клеток-потомков в направлении костеобразования. Часть этих клеток мигрирует в кровоток, достигает области дефекта и тратится здесь на репарацию кости. Есть также предположение,что при сенильном остеопорозе в результате таких повторных миграций пул ДОКП в некоторых участках скелета постепенно истощается. Однако фактические сведения по этому вопросу отсутствовали.
Степень выполнения поставленных задач:
Задачи, поставленные в проекте, в целом выполнены, а именно получены данные о возрастных изменениях популяции стромальных клоногенных клеток, а также детерминированных и индуцибельных остеогенных клеток-предшественников. Предположение о возможном участии ИОКП в процессах репарации костных дефектов проверены на модели индукции эктопического остеогенеза в условиях повышенного запроса на остеогенные клетки (кюретаж костномозговой полости).
Полученные важнейшие результаты:
В ходе выполнения проекта получены новые данные о том, как меняется с возрастом численность стромальных клоногенных клеток (КОК-ф) в кроветворных и лимфоидных органах (костном мозге, селезенке и тимусе) у мышей и морских свинок. Для проведения этой работы клетки костного мозга, селезенки и тимуса эксплантировали в монослойные культуры, где cтромальные клетки-предшественники обеспечивают развитие изолированных колоний-клонов, по числу которых можно судить о количестве стромальных клеток-предшественников в эксплантируемых взвесях. Показано, что у 2-х недельных мышей содержание КОК-ф в костном мозге бедренной кости весьма мало (48 + 12), однако, уже к 2-м месяцам количество этих клеток поднимается до 2155 + 320, поддерживается на этом уровне до 10 месяцев и к двум годам жизни животных снижается примерно вдвое (до 1114 + 85 ).
В костном мозге бедра 2-х недельных морских свинок содержание КОК-ф весьма значительно (4574 + 319), у 5-и месячных животных оно составляет 2112 + 352, а у 3-х годовалых - лишь 934 + 244. В селезенке 2-х недельных мышей содержится 54 +11 КОК-ф, к 2-м месяцам этих клеток уже в 4 раза больше (229 + 27), однако с возрастом количество КОК-ф в этом органе неуклонно падает (55 + 10 у 5-и месячных мышей и 28 + 6 у 2-х годовалых). В селезенке морских свинок содержание стволовых стромальных клеток с возрастом снижается незначительно (не более, чем на 40%). В тимусе мышей содержание КОК-ф существенно падает с возрастом ( от 233 + 104 у 2-х месячных мышей до 62 + 4 у 5-и месячных и 11 + 1 у 10-и месячных животных ). В тимусе 5-и месячных морских свинок содержится 2077 + 899 КОК-ф, но к первому году жизни их уже вдвое меньше (1082 + 563 ), а к третьему - всего лишь 27 + 6.
Таким образом, показано, что содержание стромальных клоногенных клеток в кроветворных и лимфоидных органах мышей и морских свинок с возрастом падает. Наиболее сильно это падение выражено в тимусе мышей и морских свинок и в селезенке мышей (более, чем в 12 , 75 и 8 раз соответственно). В костном мозге старых мышей и морских свинок (2-3 года) отмечено двухкратное, а в селезенке старых морских свинок - 40% падение содержания КОК-ф по сравнению с более молодыми (5-и месячными) животными. Заметно более существенное снижение количества КОК-ф в селезенке старых мышей по сравнению со старыми морскими свинками по-видимому объясняется разной межвидовой функциональной нагрузкой на этот орган - в самом деле, у мышей селезенка является кроветворно-лимфоидным органом; у морских свинок - лимфоидным.
Поскольку известно, что популяция КОК-ф костного мозга состоит из ДОКП, а в состав популяции КОК-ф селезенки и тимуса входят ИОКП, полученные данные указывают на возможность снижения численности обеих популяций предшественников при старении. Следует учесть, что КОК-ф кроветворных и лимфоидных органов подразделяются на две фракции - легко отделяемые КОК-ф, которые можно выделить с помощью простой механической дезагрегации ткани и прочносвязанные КОК-ф, которые можно высвободить только с помощью трипсинизации. В ходе выполнения проекта показано, что численность КОК-ф костного мозга и селезенки обеих этих фракций снижается с возрастом примерно в равной степени. Из этого следует, что возрастное изменение численности затрагивает всю популяцию КОК-ф и не может быть объяснено переходом части КОК-ф из одной фракции в другую. Полученные в работе данные указывают на двухкратное снижение численности ДОКП при старении. В ходе выполнения проекта показано, что и размер кроветворного органа, который формируется при трансплантации под почечную капсулу половины содержимого костномозговой полости бедра старых мышей падает в 2 раза по сравнению с более молодыми животными.
Из этих данных следует, что при старении в костном мозге существенно снижается и количество клеток, способных строить специфическое микроокружение. Для того чтобы определить, как меняется с возрастом численность ИОКП, клетки селезенки молодых (2 месяца) и старых (12 - 24 месяца) морских свинок в разных концентрациях (2х107, 6х106, 2х106, 106 и 4х105) были помещены в диффузионные камеры в присутствии индуктора остеогенеза - переходного эпителия гомологичного мочевого пузыря, взятого от животных среднего возраста (5-6 месяцев). Оказалось, что активность щелочной фосфатазы и количество костных очагов в камерах падали с уменьшением концентрации клеток селезенки, как у молодых, так и у старых животных, примерно в равной степени.
При использовании одинаковой концентрации селезеночных клеток, взятых от доноров разных возрастных групп, количество индуцированной костной ткани не сильно отличалось. При этом остеогенез имел место, если в камеру помещали не менее 2х106 клеток селезенки, независимо от возраста доноров. Таким образом, методом лимитирующих разведений взвесей клеток селезенки не удалось выявить существенной разницы в концентрации ИОКП у морских свинок разного возраста. Однако, из того факта, что общее содержание ядерных клеток в селезенке морских свинок с возрастом падает примерно вдвое, следует, что содержание ИОКП в этом органе у старых (2-3 годовалых) морских свинок также уменьшается в 2 раза. Надо отметить, что в селезенке старых морских свинок содержание КОК-ф также падало примерно вдвое.
Таким образом, по крайней мере, для селезенки морских свинок установлена корреляция между числом КОК-ф и количеством ИОКП в этом органе, свидетельствующая о том, что численность этих двух категорий клеток с возрастом меняется сходным образом. К сожалению, данные о численности ИОКП в тимусе животных разного возраста, а также данные о том, какая часть КОК-ф селезенки является ИОКП, получить не удалось в связи с недостатком финансирования. Однако, необычайно резкое (в 12 и 75 раз) падение содержания КОК-ф в тимусе старых мышей и морских свинок, связанное, по-видимому, с возрастной инволюцией этого органа, свидетельствует о том, что численность ИОКП тимуса (входящих, как было ранее показано, в категорию его КОК-ф) с возрастом также падает. Таким образом, из приведенных данных следует, что число ИОКП в кроветворных и лимфоидных органах снижается с возрастом животных.
Однако, селезенка и тимус далеко не единственно возможные источники ИОКП в организме. Известно, что, в отличие от ДОКП, которые присутствуют только среди костномозговых клеток, индуцибельные остеогенные клетки-предшественники широко распространены в организме. В частности, ИОКП присутствуют и в подкожной и в межмышечной соединительной ткани, поэтому подсадка специфических индукторов остеогенеза (переходного эпителия слизистой мочевого пузыря или декальцинированного костного матрикса) в открытой системе под кожу или фасцию приводит к образованию эктопической костной ткани. В данной работе показано, что масса эктопической костной ткани индуцированной переходным эпителием мочевого пузыря в открытой системе у старых животных оказывается в несколько раз меньше по сравнению с молодыми животными. Таким образом, способность к образованию эктопической костной ткани под действием индуктора остеогенеза, за которую ответственны ИОКП, присутствующие в соединительной ткани, с возрастом существенно снижается.
На сегодняшний день неясно, однако, в какой мере это происходит за счет а) возрастного снижения численности ИОКП соединительной ткани, б) возрастного снижения индуцирующей активности эпителия, в) возрастного снижения чувствительности ИОКП к действию остеоиндуктора. Эти вопросы могут являться предметом дальнейшего исследования, ответы, по крайней мере, на некоторые из них предполагается получить к апрелю 2000 года. Как уже сообщалось, существует предположение, что ИОКП могут в случае повышенного запроса на остеогенные клетки участвовать в построении костной ткани, однако, фактические сведения по этому вопросу отсутсвовали.
В данной работе удалось показать, что после кюретажа костномозговой полости голени морских свинок существенно (в 3 раза) падает масса эктопической костной ткани, индуцированной эпителием мочевого пузыря. Этот факт указывает на возможную функциональную связь между пулом детерминированных и индуцибельных остеогенных предшественников и служит косвенным свидетельством в пользу предположения об участии ИОКП в процессах репарации травм костной ткани. Действительно, одно из возможных объяснений полученных данных может состоять в том, что часть ИОКП соединительной ткани, обеспечивающих эктопический остеогенез, мигрирует через кровоток в область костного дефекта. Однако, это предположение нуждается в дальнейшей экспериментальной проверке.
Степень новизны полученных результатов:
Все полученные в ходе выполнения проекта данные о снижении численности стромальных клеток-предшественников с возрастом являются новыми и представляются весьма значимыми для дальнейших работ по определению роли этих клеток в развитии сенильного остеопороза.
Сопоставление с мировым уровнем:
Взрослые млекопитаюшие снабжены двумя типами остеогенных клеток-предшественников, способных при эксплантации ин витро образовывать колонии- клоны фибробластов, имеющих остеогенные свойства: детерминированными остеогенными предшественниками (ДОКП) и индуцибельными остеогенными предшественниками (ИОКП). И те, и другие имеют основные характеристики стволовых клеток; при эксплантации вступают в G1 - период клеточного цикла и сохраняют свои остеогенные потенции при пассировании в культурах. В отличие от детерминированных, индуцибельные остеогенные клетки- предшественники требуют для костеобразования специальных факторов индукции остеогенеза (А.Я. Фриденштейн, К.С. Лалыкина ,1970-1973 гг.). Составляющие категорию ДОКП стволовые клетки костной ткани и коммитированные остеогенные клетки- предшественники были обнаружены в составе стромы костного мозга взрослых млекопитающих и человека сравнительно недавно.
В стационарном состоянии эти клетки удерживаются в G0-периоде клеточного цикла, но в культурах костного мозга они ведут себя, как клоногенные клетки с высоким пролиферативным потенциалом. Это и позволяет выявить их в таких культурах по способности образовывать колонии стромальных фибробластов (КОК-ф колонии), являющиеся клеточными клонами. При пассировании ин витро индивидуальных КОК-ф колоний возникают диплоидные моноклональные штаммы фибробластов с неодинаковыми дифференцировочными потенциалами. Это обнаруживается при переносе ин витро штаммов фибробластов, полученных из индивидуальных КОК-ф: при трансплантации в диффузионных камерах 10 % штаммов образуют одновременно костную, хрящевую и ретикулярную ткань; 50% - только костную ткань; 27% - только ретикулярную ткань костного мозга. Это свидетельствует о том, что КОК-ф неодинаковы в смысле положения, которое они занимают в иерархии костномозговых стромальных клеток, и часть из них является, соответственно, стволовыми остеогенными клетками, коммитированными остеогенными предшественниками и коммитированными предшественниками ретикулярных костномозговых клеток (А.Я. Фриденштейн с соавт., 1985-1990гг.).
В последние 10 лет костномозговым остеогенным стволовым клеткам и коммитированным остеогенным предшественникам уделяется большое внимание во многих отечественных и зарубежных лабораториях, занимающихся морфогенезам и специально костной тканью. С одной стороны, весьма важной представляется роль остеогенных предшественников в развитии патологии костной ткани. Высказано предположение (А.Я.Фриденштейн, A.Kahn), что одной из причин возрастного остеопороза может являться качественная и количественная дефектность этой категории клеток. Действительно, в последние несколько лет были получены данные о возрастном снижении концентрации стромальных колониеобразующих клеток и костеобразовательного потенциала костного мозга (A.Kahn).
Надо отметить, что эти данные получены в культурах, где остеогенез был стимулирован добавлением дексаметазона, что затрудняет интерпретацию полученных результатов. С другой стороны, как уже указывалось выше, высказано предположение, что популяции ИОКП и ДОКП являются согласованно действующими участниками единого пула остеогенных предшественников во взрослом организме. Вопрос об иерархическом соотношении популяций ДОКП и ИОКП и их возможной функциональной связи, в частности, вопрос о возможности участия ИОКП в репарации поврежденной костной ткани на сегодняшний день также остается открытым.
Таким образом, полученные в настоящей работе данные о возрастном снижении численности КОК-ф, ДОКП и ИОКП в кроветворных и лимфоидных органах, а также данные о влиянии кюретажа костномозговой полости на процесс эктопического остеогенеза, свидетельствующие в пользу гипотезы о существовании в организме единого пула функционално связанных остеогенных предшественников, объем которого с возрастом может снижаться, сопоставимы с мировым уровнем и представляется весьма важными для понимания роли этих категорий клеток в развитии возрастного остеопороза.
Следует отметить, что все имеющиеся на сегодняшний день сведения о возрастном снижении численности КОК-ф в кроветворных и лимфоидных органах получены для фракции КОК-ф, поддающейся механической дезагрегации, поскольку именно этот метод приготовления клеточных взвесей для культивирования КОК-ф является сейчас общеупотребимым. Между тем, следовало учесть вероятность того, что это снижение может объясняться переходом у старых животных части КОК-ф из <механической> фракции во фракцию, которую можно выделить только с помощью трипсина. Таким образом, полученные в настоящей работе данные о том, что возрастное снижение численности имеет место во всей популяции КОК-ф, также сопоставимы с мировым уровнем.
Использованные методы и подходы:
Методы и подходы, используемые в данном проекте, являются оригинальными и часть из них разработана в лаборатории, где выполнялось данное исследование. Основным методом при проведении настоящего проекта был разработанный А.Я.Фриденштейном с сотр. В 1970 - 1980 гг. метод клонирования стволовых стромальных клеток кроветворных и лимфоидных органов в монослойных культурах.
Конкретно нами использовалась одна из его модификаций, а именно, метод культивирования адгезивных клеток костного мозга, селезенки и тимуса в присутствии стандартного фидера, который дает более точное представление о содержании стволовых стромальных клеток в эксплантируемых взвесях (Н.В.Лациник и др. 1990г).
Предварительно нами было показано, что:
метод культивирования адгезивных клеток, в общем, пригоден для клонирования КОК-ф селезенки и тимуса, поскольку КОК-ф из этих органов обладают, подобно КОК-ф костного мозга, достаточно высокой скоростью адгезии;
КОК-ф у молодых и старых животных в одинаковой степени чувствительны к колониестимулирующему действию клеток костномозгового фидера;
направленное на КОК-ф колониестимулирующее действие костномозговых фидерных клеток, взятых от молодых и старых животных, выражено практически одинаково.
Таким образом, в данной работе определены режим и методы культивирования стромальных клоногенных клеток селезенки и тимуса животных разного возраста. В ходе выполнения проекта использовались также следующие основные методы:
метод выделения КОК-ф селезенки с помощью трипсина (этот метод был впервые разработан в нашей лаборатории для костного мозга и модифицирован в ходе настоящей работы применительно к селезенке);
метод получения штаммов стромальных фибробластов селезенки и тимуса;
метод индукции остеогенеза при совместном культивировании в диффузионных камерах клеток специфического индуктора остеогенеза (переходного эпителия мочевого пузыря) с клетками кроветворных и лимфоидных органов;
метод лимитирующих разведений клеток селезенки и тимуса, подвергшихся трансплантации в диффузионных камерах в присутствии индуктора остеогенеза - переходного эпителия мочевого пузыря;
метод получения эктопической костной ткани в открытой системе под действием ауто и гомологичного эпителия мочевого пузыря.
Все используемые в ходе выполнения проекта методы были развиты и усовершенствованы авторами настоящей работы.
ПУБЛИКАЦИИ
1. Возрастные изменения содержания стромальных клоногенных клеток (КОК-ф) в кроветворных и лимфоидных органах. Фриденштейн А.Я. Горская Ю.Ф. Лациник Н.В. Шуклина Е.Ю. Нестеренко В.Г. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 127(5) (1999) 550-553