Популяционная структура стромальных остеогенных клеток костного мозга

Объявленные ранее цели проекта:
Данный проект был направлен на решение одной из фундаментальных задач клеточной физиологии и патологии, связанной с определением популяционной структуры стромальных остеогенных клеток костного мозга. Конкретная задача проекта заключалась в том, чтобы выяснить, какие сдвиги происходят при старении в структуре популяции стромальных клоногенных клеток (КОК-ф), а также детерминированных (ДОКП) и индуцибельных (ИОКП) остеогенных клеток-предшественников. К детерминированным остеогенным клеткам-предшественникам относятся те костномозговые стромальные клетки, которые способны реализовать свои дифференцировочные потенции в отсутствие специальных индукторов остеогенеза. В отличие от детерминированных, индуцибельные остеогенные клетки- предшественники требуют для костеообразования специальных факторов индукции остеогенеза. ДОКП входят в состав популяции стромальных клоногенных клеток костного мозга, а и ИОКП - в состав популяции стромальных клоногенных клеток селезенки и тимуса. ИОКП также содержатся в периферической крови и соединительной ткани. Существует предположение, что в организме существует единый пул функционально связанных остеогенных клеток- предшественников.

При возникновении дефектов скелета в результате, например, травмы, ДОКП индуцируются к пролиферации, что приводит к образованию новой костной ткани и, тем самым, обеспечивается репарация дефекта. Предполагается, что одновременно, травма кости активирует ИОКП, вызывает их пролиферацию и дифференцировку их клеток-потомков в направлении костеобразования. Часть этих клеток мигрирует в кровоток, достигает области дефекта и тратится здесь на репарацию кости. Есть также предположение,что при сенильном остеопорозе в результате таких повторных миграций пул ДОКП в некоторых участках скелета постепенно истощается. Однако фактические сведения по этому вопросу отсутствовали.

Степень выполнения поставленных задач:
Задачи, поставленные в проекте, в целом выполнены, а именно получены данные о возрастных изменениях популяции стромальных клоногенных клеток, а также детерминированных и индуцибельных остеогенных клеток-предшественников. Предположение о возможном участии ИОКП в процессах репарации костных дефектов проверены на модели индукции эктопического остеогенеза в условиях повышенного запроса на остеогенные клетки (кюретаж костномозговой полости).

Полученные важнейшие результаты:
В ходе выполнения проекта получены новые данные о том, как меняется с возрастом численность стромальных клоногенных клеток (КОК-ф) в кроветворных и лимфоидных органах (костном мозге, селезенке и тимусе) у мышей и морских свинок. Для проведения этой работы клетки костного мозга, селезенки и тимуса эксплантировали в монослойные культуры, где cтромальные клетки-предшественники обеспечивают развитие изолированных колоний-клонов, по числу которых можно судить о количестве стромальных клеток-предшественников в эксплантируемых взвесях. Показано, что у 2-х недельных мышей содержание КОК-ф в костном мозге бедренной кости весьма мало (48 + 12), однако, уже к 2-м месяцам количество этих клеток поднимается до 2155 + 320, поддерживается на этом уровне до 10 месяцев и к двум годам жизни животных снижается примерно вдвое (до 1114 + 85 ).

В костном мозге бедра 2-х недельных морских свинок содержание КОК-ф весьма значительно (4574 + 319), у 5-и месячных животных оно составляет 2112 + 352, а у 3-х годовалых - лишь 934 + 244. В селезенке 2-х недельных мышей содержится 54 +11 КОК-ф, к 2-м месяцам этих клеток уже в 4 раза больше (229 + 27), однако с возрастом количество КОК-ф в этом органе неуклонно падает (55 + 10 у 5-и месячных мышей и 28 + 6 у 2-х годовалых). В селезенке морских свинок содержание стволовых стромальных клеток с возрастом снижается незначительно (не более, чем на 40%). В тимусе мышей содержание КОК-ф существенно падает с возрастом ( от 233 + 104 у 2-х месячных мышей до 62 + 4 у 5-и месячных и 11 + 1 у 10-и месячных животных ). В тимусе 5-и месячных морских свинок содержится 2077 + 899 КОК-ф, но к первому году жизни их уже вдвое меньше (1082 + 563 ), а к третьему - всего лишь 27 + 6.

Таким образом, показано, что содержание стромальных клоногенных клеток в кроветворных и лимфоидных органах мышей и морских свинок с возрастом падает. Наиболее сильно это падение выражено в тимусе мышей и морских свинок и в селезенке мышей (более, чем в 12 , 75 и 8 раз соответственно). В костном мозге старых мышей и морских свинок (2-3 года) отмечено двухкратное, а в селезенке старых морских свинок - 40% падение содержания КОК-ф по сравнению с более молодыми (5-и месячными) животными. Заметно более существенное снижение количества КОК-ф в селезенке старых мышей по сравнению со старыми морскими свинками по-видимому объясняется разной межвидовой функциональной нагрузкой на этот орган - в самом деле, у мышей селезенка является кроветворно-лимфоидным органом; у морских свинок - лимфоидным.

Поскольку известно, что популяция КОК-ф костного мозга состоит из ДОКП, а в состав популяции КОК-ф селезенки и тимуса входят ИОКП, полученные данные указывают на возможность снижения численности обеих популяций предшественников при старении. Следует учесть, что КОК-ф кроветворных и лимфоидных органов подразделяются на две фракции - легко отделяемые КОК-ф, которые можно выделить с помощью простой механической дезагрегации ткани и прочносвязанные КОК-ф, которые можно высвободить только с помощью трипсинизации. В ходе выполнения проекта показано, что численность КОК-ф костного мозга и селезенки обеих этих фракций снижается с возрастом примерно в равной степени. Из этого следует, что возрастное изменение численности затрагивает всю популяцию КОК-ф и не может быть объяснено переходом части КОК-ф из одной фракции в другую. Полученные в работе данные указывают на двухкратное снижение численности ДОКП при старении. В ходе выполнения проекта показано, что и размер кроветворного органа, который формируется при трансплантации под почечную капсулу половины содержимого костномозговой полости бедра старых мышей падает в 2 раза по сравнению с более молодыми животными.

Из этих данных следует, что при старении в костном мозге существенно снижается и количество клеток, способных строить специфическое микроокружение. Для того чтобы определить, как меняется с возрастом численность ИОКП, клетки селезенки молодых (2 месяца) и старых (12 - 24 месяца) морских свинок в разных концентрациях (2х107, 6х106, 2х106, 106 и 4х105) были помещены в диффузионные камеры в присутствии индуктора остеогенеза - переходного эпителия гомологичного мочевого пузыря, взятого от животных среднего возраста (5-6 месяцев). Оказалось, что активность щелочной фосфатазы и количество костных очагов в камерах падали с уменьшением концентрации клеток селезенки, как у молодых, так и у старых животных, примерно в равной степени.

При использовании одинаковой концентрации селезеночных клеток, взятых от доноров разных возрастных групп, количество индуцированной костной ткани не сильно отличалось. При этом остеогенез имел место, если в камеру помещали не менее 2х106 клеток селезенки, независимо от возраста доноров. Таким образом, методом лимитирующих разведений взвесей клеток селезенки не удалось выявить существенной разницы в концентрации ИОКП у морских свинок разного возраста. Однако, из того факта, что общее содержание ядерных клеток в селезенке морских свинок с возрастом падает примерно вдвое, следует, что содержание ИОКП в этом органе у старых (2-3 годовалых) морских свинок также уменьшается в 2 раза. Надо отметить, что в селезенке старых морских свинок содержание КОК-ф также падало примерно вдвое.

Таким образом, по крайней мере, для селезенки морских свинок установлена корреляция между числом КОК-ф и количеством ИОКП в этом органе, свидетельствующая о том, что численность этих двух категорий клеток с возрастом меняется сходным образом. К сожалению, данные о численности ИОКП в тимусе животных разного возраста, а также данные о том, какая часть КОК-ф селезенки является ИОКП, получить не удалось в связи с недостатком финансирования. Однако, необычайно резкое (в 12 и 75 раз) падение содержания КОК-ф в тимусе старых мышей и морских свинок, связанное, по-видимому, с возрастной инволюцией этого органа, свидетельствует о том, что численность ИОКП тимуса (входящих, как было ранее показано, в категорию его КОК-ф) с возрастом также падает. Таким образом, из приведенных данных следует, что число ИОКП в кроветворных и лимфоидных органах снижается с возрастом животных.

Однако, селезенка и тимус далеко не единственно возможные источники ИОКП в организме. Известно, что, в отличие от ДОКП, которые присутствуют только среди костномозговых клеток, индуцибельные остеогенные клетки-предшественники широко распространены в организме. В частности, ИОКП присутствуют и в подкожной и в межмышечной соединительной ткани, поэтому подсадка специфических индукторов остеогенеза (переходного эпителия слизистой мочевого пузыря или декальцинированного костного матрикса) в открытой системе под кожу или фасцию приводит к образованию эктопической костной ткани. В данной работе показано, что масса эктопической костной ткани индуцированной переходным эпителием мочевого пузыря в открытой системе у старых животных оказывается в несколько раз меньше по сравнению с молодыми животными. Таким образом, способность к образованию эктопической костной ткани под действием индуктора остеогенеза, за которую ответственны ИОКП, присутствующие в соединительной ткани, с возрастом существенно снижается.

На сегодняшний день неясно, однако, в какой мере это происходит за счет а) возрастного снижения численности ИОКП соединительной ткани, б) возрастного снижения индуцирующей активности эпителия, в) возрастного снижения чувствительности ИОКП к действию остеоиндуктора. Эти вопросы могут являться предметом дальнейшего исследования, ответы, по крайней мере, на некоторые из них предполагается получить к апрелю 2000 года. Как уже сообщалось, существует предположение, что ИОКП могут в случае повышенного запроса на остеогенные клетки участвовать в построении костной ткани, однако, фактические сведения по этому вопросу отсутсвовали.

В данной работе удалось показать, что после кюретажа костномозговой полости голени морских свинок существенно (в 3 раза) падает масса эктопической костной ткани, индуцированной эпителием мочевого пузыря. Этот факт указывает на возможную функциональную связь между пулом детерминированных и индуцибельных остеогенных предшественников и служит косвенным свидетельством в пользу предположения об участии ИОКП в процессах репарации травм костной ткани. Действительно, одно из возможных объяснений полученных данных может состоять в том, что часть ИОКП соединительной ткани, обеспечивающих эктопический остеогенез, мигрирует через кровоток в область костного дефекта. Однако, это предположение нуждается в дальнейшей экспериментальной проверке.

Степень новизны полученных результатов:
Все полученные в ходе выполнения проекта данные о снижении численности стромальных клеток-предшественников с возрастом являются новыми и представляются весьма значимыми для дальнейших работ по определению роли этих клеток в развитии сенильного остеопороза.

Сопоставление с мировым уровнем:
Взрослые млекопитаюшие снабжены двумя типами остеогенных клеток-предшественников, способных при эксплантации ин витро образовывать колонии- клоны фибробластов, имеющих остеогенные свойства: детерминированными остеогенными предшественниками (ДОКП) и индуцибельными остеогенными предшественниками (ИОКП). И те, и другие имеют основные характеристики стволовых клеток; при эксплантации вступают в G1 - период клеточного цикла и сохраняют свои остеогенные потенции при пассировании в культурах. В отличие от детерминированных, индуцибельные остеогенные клетки- предшественники требуют для костеобразования специальных факторов индукции остеогенеза (А.Я. Фриденштейн, К.С. Лалыкина ,1970-1973 гг.). Составляющие категорию ДОКП стволовые клетки костной ткани и коммитированные остеогенные клетки- предшественники были обнаружены в составе стромы костного мозга взрослых млекопитающих и человека сравнительно недавно.

В стационарном состоянии эти клетки удерживаются в G0-периоде клеточного цикла, но в культурах костного мозга они ведут себя, как клоногенные клетки с высоким пролиферативным потенциалом. Это и позволяет выявить их в таких культурах по способности образовывать колонии стромальных фибробластов (КОК-ф колонии), являющиеся клеточными клонами. При пассировании ин витро индивидуальных КОК-ф колоний возникают диплоидные моноклональные штаммы фибробластов с неодинаковыми дифференцировочными потенциалами. Это обнаруживается при переносе ин витро штаммов фибробластов, полученных из индивидуальных КОК-ф: при трансплантации в диффузионных камерах 10 % штаммов образуют одновременно костную, хрящевую и ретикулярную ткань; 50% - только костную ткань; 27% - только ретикулярную ткань костного мозга. Это свидетельствует о том, что КОК-ф неодинаковы в смысле положения, которое они занимают в иерархии костномозговых стромальных клеток, и часть из них является, соответственно, стволовыми остеогенными клетками, коммитированными остеогенными предшественниками и коммитированными предшественниками ретикулярных костномозговых клеток (А.Я. Фриденштейн с соавт., 1985-1990гг.).

В последние 10 лет костномозговым остеогенным стволовым клеткам и коммитированным остеогенным предшественникам уделяется большое внимание во многих отечественных и зарубежных лабораториях, занимающихся морфогенезам и специально костной тканью. С одной стороны, весьма важной представляется роль остеогенных предшественников в развитии патологии костной ткани. Высказано предположение (А.Я.Фриденштейн, A.Kahn), что одной из причин возрастного остеопороза может являться качественная и количественная дефектность этой категории клеток. Действительно, в последние несколько лет были получены данные о возрастном снижении концентрации стромальных колониеобразующих клеток и костеобразовательного потенциала костного мозга (A.Kahn).

Надо отметить, что эти данные получены в культурах, где остеогенез был стимулирован добавлением дексаметазона, что затрудняет интерпретацию полученных результатов. С другой стороны, как уже указывалось выше, высказано предположение, что популяции ИОКП и ДОКП являются согласованно действующими участниками единого пула остеогенных предшественников во взрослом организме. Вопрос об иерархическом соотношении популяций ДОКП и ИОКП и их возможной функциональной связи, в частности, вопрос о возможности участия ИОКП в репарации поврежденной костной ткани на сегодняшний день также остается открытым.

Таким образом, полученные в настоящей работе данные о возрастном снижении численности КОК-ф, ДОКП и ИОКП в кроветворных и лимфоидных органах, а также данные о влиянии кюретажа костномозговой полости на процесс эктопического остеогенеза, свидетельствующие в пользу гипотезы о существовании в организме единого пула функционално связанных остеогенных предшественников, объем которого с возрастом может снижаться, сопоставимы с мировым уровнем и представляется весьма важными для понимания роли этих категорий клеток в развитии возрастного остеопороза.

Следует отметить, что все имеющиеся на сегодняшний день сведения о возрастном снижении численности КОК-ф в кроветворных и лимфоидных органах получены для фракции КОК-ф, поддающейся механической дезагрегации, поскольку именно этот метод приготовления клеточных взвесей для культивирования КОК-ф является сейчас общеупотребимым. Между тем, следовало учесть вероятность того, что это снижение может объясняться переходом у старых животных части КОК-ф из <механической> фракции во фракцию, которую можно выделить только с помощью трипсина. Таким образом, полученные в настоящей работе данные о том, что возрастное снижение численности имеет место во всей популяции КОК-ф, также сопоставимы с мировым уровнем.

Использованные методы и подходы:
Методы и подходы, используемые в данном проекте, являются оригинальными и часть из них разработана в лаборатории, где выполнялось данное исследование. Основным методом при проведении настоящего проекта был разработанный А.Я.Фриденштейном с сотр. В 1970 - 1980 гг. метод клонирования стволовых стромальных клеток кроветворных и лимфоидных органов в монослойных культурах.

Конкретно нами использовалась одна из его модификаций, а именно, метод культивирования адгезивных клеток костного мозга, селезенки и тимуса в присутствии стандартного фидера, который дает более точное представление о содержании стволовых стромальных клеток в эксплантируемых взвесях (Н.В.Лациник и др. 1990г).

Предварительно нами было показано, что:

метод культивирования адгезивных клеток, в общем, пригоден для клонирования КОК-ф селезенки и тимуса, поскольку КОК-ф из этих органов обладают, подобно КОК-ф костного мозга, достаточно высокой скоростью адгезии;
КОК-ф у молодых и старых животных в одинаковой степени чувствительны к колониестимулирующему действию клеток костномозгового фидера;
направленное на КОК-ф колониестимулирующее действие костномозговых фидерных клеток, взятых от молодых и старых животных, выражено практически одинаково.
Таким образом, в данной работе определены режим и методы культивирования стромальных клоногенных клеток селезенки и тимуса животных разного возраста. В ходе выполнения проекта использовались также следующие основные методы:

метод выделения КОК-ф селезенки с помощью трипсина (этот метод был впервые разработан в нашей лаборатории для костного мозга и модифицирован в ходе настоящей работы применительно к селезенке);
метод получения штаммов стромальных фибробластов селезенки и тимуса;
метод индукции остеогенеза при совместном культивировании в диффузионных камерах клеток специфического индуктора остеогенеза (переходного эпителия мочевого пузыря) с клетками кроветворных и лимфоидных органов;
метод лимитирующих разведений клеток селезенки и тимуса, подвергшихся трансплантации в диффузионных камерах в присутствии индуктора остеогенеза - переходного эпителия мочевого пузыря;
метод получения эктопической костной ткани в открытой системе под действием ауто и гомологичного эпителия мочевого пузыря.
Все используемые в ходе выполнения проекта методы были развиты и усовершенствованы авторами настоящей работы.

ПУБЛИКАЦИИ
1.    Возрастные изменения содержания стромальных клоногенных клеток (КОК-ф) в кроветворных и лимфоидных органах. Фриденштейн А.Я. Горская Ю.Ф. Лациник Н.В. Шуклина Е.Ю. Нестеренко В.Г. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 127(5) (1999) 550-553

Автор
Горская Ю.Ф.
Автор 2
Лациник Н.В.
Summary
The aim of the project was the definition of the changes which took place in population structure of stromal clonogenic cells (CFU-f), determined osteogenic precursor cells (DOPC) and inducible osteogenic precursor cells (IOPC) with growing old. Two experimental methods have been used in this project: a) the in vitro colony assay for bone marrow, spleen and thymuse CFU-f, b) method of inducible osteogenesis by transitional epithelium in diffusion chambers and in open system. It has been shown that the contents of stromal clonogenic cells (CFU-f) in haemopoetic and lymphoid organs of mice and guinea pigs decreased with the age of animals. Mostly great this decrease was expressed in thymuse of mice and guinea pigs and in mice spleen (more than 12, 75 and 8 times respectively). In bone marrow of old mice and guinea pigs (2 - 3 years old) the twofold decrease of CFU-f was fixed in comparison with more young animals (5 month old animals). In spleen of old guinea pigs - 40% decrease of CFU-f was fixed in comparison with more young animals. It has been shown that the content of stromal clonogenic cells (CFU-f) decreased with the age of animals both in mechanical and trypsin desaggregated fractions of CFU-f. These results indicate that the age decrease of CFU-f content takes place in total population of CFU-f and can`t be explained by the transfer of CFU-f from one fraction to the other. The regime and cultivation conditions of spleen and thymuse CFU-f of mice and guinea pigs were worked out which allowed to value the amount of these cells in explanted cell suspensions. It has been shown that the content of IOPC in spleen and thymuse decreased with age of animals. The ability for inducible osteogenesis (when transitional epitelium was placed in the open system) decreased more than 3 times with growing old. Curetage of bone marrow cavity led to 3-times decrease of induced bone tissue. These results indicate the possibility of functional connection between DOPC and IOPC populations and supposition about involving IOPC in bone defect`s reparation. In total the data received certificate the decrease of CFU-f, DOPC and IOPC amount with growing old. This seems to be important in understanding of the role of these cells` categories in the development of senial osteoporosis.
Аннотация
Задача данного проекта заключалась в том, чтобы выяснить, какие сдвиги происходят при старении в структуре популяции стромальных клоногенных клеток (КОК-ф), а также детерминированных (ДОКП) и индуцибельных (ИОКП) остеогенных клеток-предшественников. В работе использованы два основных метода: а) метод клонирования КОК-ф кроветворных и лимфоидных органов в монослойных культурах, б) метод получения эктопического костеобразования под действием индуктора остеогенеза (переходного эпителия мочевого пузыря) в диффузионных камерах и в открытой системе. В ходе работы было показано, что содержание стромальных клоногенных клеток (КОК-ф) в кроветворных и лимфоидных органах мышей и морских свинок падает с возрастом животных. Наиболее значительно это падение выражено в тимусе мышей и морских свинок и в селезенке мышей (более, чем в 12, 75 и 8 раз соответственно). В костном мозге старых мышей и морских свинок (2-3 года), а также в селезенке старых морских свинок отмечено двухкратное падение содержания КОК-ф по сравнению с более молодыми (5-и месячными) животными. Оказалось, что возрастное падение численности в равной степени затрагивает всю популяцию КОК-ф (т.е. как фракцию слабосвязанных стромальных клоногенных клеток, которая выделяется с помощью механической дезагрегации ткани, так и ту их фракцию, которую можно выделить только с помощью трипсина). Из этого следует, что с возрастом происходит истинное снижение численности стромальных клоногенных клеток, которое нельзя объяснить переходом части этих клеток из одной фракции в другую. В ходе выполнения проекта был усовершенствован метод монослойного культивирования клеток кроветворных и лимфоидных органов применительно к стромальным клоногенным клеткам селезенки и тимуса. Показано, что численность ИОКП в кроветворных и лимфоидных органах с возрастом также существенно снижается. Выяснилось, что с возрастом более чем в три раза снижается и способность к образованию эктопической костной ткани при посадке индуктора в открытой системе, за которую ответственны ИОКП, присутствующие в соединительной ткани. Показано, что после кюретажа костномозговой полости голени морских свинок, т.е. в условиях повышенного запроса на остеогенные клетки, существенно (в 3 раза) падает масса индуцированной эктопической костной ткани, что указывает на возможную функциональную связь между пулом ДОКП и ИОКП и служит косвенным свидетельством в пользу предположения об участии ИОКП в процессах репарации травм костной ткани. В целом, полученные данные указывают на снижение численности стромальных клеток-предшественников (КОК-ф, ДОКП и ИОКП) при старении, что представляется важным для понимания роли этих категорий клеток в развитии сенильного остеопороза.
Категория
Ключевые слова
стромальный, остеогенный, клетка, костный мозг, клоногенные клетки
Название на английском
Population structure of stromal osteogenic cells in bone marrow
Организация
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (НИИЭМ РАМН) г. Москва
Организация второго автора
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (НИИЭМ РАМН) г. Москва
Статус автора
Кандидат наук
Статус второго автора
Кандидат наук